王健君：中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所 研究員
一百年前科學(xué)家“水變成冰要經(jīng)過冰核”這個(gè)中間態(tài)的預(yù)言一直不能得到證實(shí)，他的團(tuán)隊(duì)攻克了這個(gè)百年的難題，并通過研究發(fā)現(xiàn)低溫動(dòng)物的抗凍蛋白控制冰晶生長(zhǎng)的控冰機(jī)制。這一基礎(chǔ)科學(xué)問題的突破，為食品、航空、醫(yī)療、生物等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了科學(xué)支持。當(dāng)冰凍過程可控，作為超越人類極限的人體凍存技術(shù)或許可以期待。
大家可能知道冷凍保存，因?yàn)槊考颐繎舳加斜洌渚陀欣鋬霰４娴墓δ?。但是大家可能也?huì)很好奇，為什么這幾年冷凍保存這么受關(guān)注,甚至有爭(zhēng)議？
比如說(shuō)關(guān)于卵母細(xì)胞的凍存，提出了完全不同的議案，有些人支持卵母細(xì)胞的凍存，而另外一些代表則完全反對(duì)卵母細(xì)胞的凍存；
2016年英國(guó)法院判決一個(gè)患有絕癥的14歲女孩的母親勝訴，允許這位母親在其女兒死后將其凍存。這個(gè)判決當(dāng)時(shí)引起了全世界的轟動(dòng)，因?yàn)榧词乖诮衲昕茖W(xué)界、法律界還有倫理等方面，對(duì)人體凍存都存在著爭(zhēng)議。
我們可以看一下冷凍保存的定義，就可以明白為什么凍存這么受關(guān)注，甚至有爭(zhēng)議。
冷凍保存就是將冷凍保存對(duì)象,如細(xì)胞、組織、器官等置于超低溫的環(huán)境當(dāng)中，一般是指在零下196℃的液氮環(huán)境當(dāng)中，使其新陳代謝大大降低，待恢復(fù)正常的生理溫度以后，這些凍存對(duì)象，細(xì)胞、組織、器官能恢復(fù)它正常的生理功能。如果將凍存對(duì)象換成人體，那就意味著幾十年以后，或者幾千年以后，這個(gè)人體如果能復(fù)蘇的話，就能實(shí)現(xiàn)永生了。
這是歷代的帝王、古代埃及的法老一直追求的夢(mèng)想。所以大家可能能明白為什么凍存這幾年這么受關(guān)注，甚至有爭(zhēng)議。
世界上真正的第一例凍存的人體叫James bedford，他在其死后接受了冷凍保存，距今已經(jīng)有五十三年了。目前世界上總共有受凍存的人體約300例，其中包括兩個(gè)中國(guó)人。
現(xiàn)在我可以很肯定的告訴大家，所有這些凍存的人，由于技術(shù)的原因，他們是不可能復(fù)蘇的。
所以也有科學(xué)家認(rèn)為將人體的冷凍保存是偽科學(xué)。但是美國(guó)的一個(gè)期刊《生活科學(xué)》，它是專門報(bào)道重大的科學(xué)突破和預(yù)測(cè)未來(lái)研究方向的一個(gè)雜志，它將人體凍存技術(shù)評(píng)為：十大超越人體極限的未來(lái)科學(xué)技術(shù)之一。
研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境的溫度降低的時(shí)候，能大大增加器官保存時(shí)間。比如說(shuō)目前的器官的保存溫度是在零上4℃，它保存的時(shí)間是幾個(gè)小時(shí)，長(zhǎng)的可以達(dá)到二十來(lái)個(gè)小時(shí)。
理論研究發(fā)現(xiàn)，如果將器官置于零下140℃的時(shí)候，可以長(zhǎng)期的保持。事實(shí)上，目前有些細(xì)胞，將其置于零下196℃的液氮環(huán)境當(dāng)中的時(shí)候，可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的凍存。可是很遺憾的是，目前還沒有凍存器官的技術(shù)。所以導(dǎo)致保存器官的時(shí)間很短，幾個(gè)小時(shí)、長(zhǎng)的二十來(lái)個(gè)小時(shí)，導(dǎo)致了大量的器官被廢棄。
研究數(shù)據(jù)顯示大約70%左右的，或者超過70%的心肺，由于短時(shí)間內(nèi)不能找到受體而被廢棄，這是非常遺憾的。因?yàn)榧词乖谄鞴僖浦卜浅０l(fā)達(dá)的美國(guó)，在七十個(gè)器官衰竭需要移植的人中，只有一個(gè)才能得到器官的移植。
所以在1970年，實(shí)施人類肝臟移植手術(shù)的，被稱為“器官移植之父”的Thomas Starzl就預(yù)言：“只有當(dāng)保存器官的技術(shù)得到突破，使器官得以保存數(shù)周、甚至數(shù)月的時(shí)候，器官移植才有可能大范圍的推廣?！?/p>
但很遺憾，他這個(gè)說(shuō)法已經(jīng)五十年過去了，現(xiàn)在的器官保存技術(shù)并沒有很大的進(jìn)步。
除了保存器官，冷凍保存還有其他很大范圍的領(lǐng)域，比如說(shuō)能挽救新冠危重患者生命的細(xì)胞療法，當(dāng)然這個(gè)細(xì)胞療法也能治帕金森病，它的大范圍的推廣,必須依賴于干細(xì)胞的安全的冷凍保存；當(dāng)然另外輔助生殖領(lǐng)域的生殖細(xì)胞的凍存，它的安全性和可靠性，也是非常關(guān)鍵的，因?yàn)檫@涉及到我們的下一代。
大家會(huì)問，為什么五十年來(lái)凍存技術(shù)沒有得到突破的進(jìn)展，或者它的關(guān)鍵的科學(xué)問題是什么呢？
其實(shí)冷凍保存有三要素：第一，當(dāng)然是凍存對(duì)象：細(xì)胞、組織、器官；大家知道器官里面有超過70%的是水分，將這些水分置于零下的時(shí)候，它必然會(huì)結(jié)冰，所以這就涉及到凍存的第二要素，這些冰如果不控制的話,它必然會(huì)傷害細(xì)胞器官。
這是一組光學(xué)顯微鏡圖片，可以看到卵母細(xì)胞在冰凍前后受到了冰晶的損害；凍存第三個(gè)要素就是要添加冷凍保護(hù)劑，使器官細(xì)胞內(nèi)避免大冰晶的產(chǎn)生，使器官受到保護(hù)，免受冰凍的傷害。
目前大量使用的凍存保護(hù)劑是一種與鹽相似的，一種跟水能發(fā)生強(qiáng)作用的分子。它的加入可以使器官內(nèi)部在低溫下面不結(jié)冰。但是要使器官內(nèi)將近70%的水分，在零下140℃下面不結(jié)冰，那必須添加大量的這種有毒的鹽。
有美國(guó)的科學(xué)家理論分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽的重量比達(dá)到50—60%的時(shí)候，器官內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)不結(jié)冰，但是我剛才說(shuō)了，這么高濃度的鹽,必然對(duì)細(xì)胞有損害。
比如說(shuō)目前普遍使用的凍存劑的一種，也是另外一種鹽的分子，當(dāng)它的濃度超過2%的時(shí)候，它會(huì)損害細(xì)胞，當(dāng)然嚴(yán)重的時(shí)候，會(huì)改變它的一些基因。
由于這個(gè)原因，所以世界上很多的科學(xué)家都努力嘗試著降低有毒的鹽分子的使用。
一個(gè)方法就是可以快速地降低溫度，然后升高溫度。在水還沒反應(yīng)過來(lái)變成冰之前，已經(jīng)達(dá)到了預(yù)期溫度。但這個(gè)方法對(duì)細(xì)胞是適用的，因?yàn)榧?xì)胞體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但是對(duì)器官是不適用的，因?yàn)槠鞴袤w積大、復(fù)雜。
這樣快速降溫、升溫的時(shí)候，必然導(dǎo)致有個(gè)溫度梯度的存在，就意味著在器官里面，有些地方溫度高，有些地方溫度低，當(dāng)然都是零下的。相對(duì)比較溫度高的地方，必然會(huì)形成大冰晶損害器官。這也是目前能凍存細(xì)胞，但是不能凍存器官的一個(gè)原因。
大家肯定會(huì)問，能不能有其他的凍存的方法避免這種有毒的鹽的使用？
其實(shí)自然界確實(shí)有一些生物，它可以在酷寒下生存。比如說(shuō)生活于沙漠地區(qū)的甲蟲，叫小胸鱉甲；生活于極地的這種雪虱；還有生活于我國(guó)東北地區(qū)的冬尺蠖；還有阿拉斯加林蛙等等。
我2013年12月去新疆采集這種蟲子，叫小胸鱉甲。當(dāng)時(shí)氣溫是零下30℃左右，當(dāng)我們把雪移開，這個(gè)蟲子就跟土壤搭在一塊，就像凍成一塊的。但是很有意思的事情，我把蟲子放在我手上幾分鐘以后，蟲子能爬起來(lái)。這確實(shí)是非常神奇。
大家可能也會(huì)問，這些蟲子體內(nèi)不可能含有大量的有毒的鹽。如果有的話，它沒被凍死可能也被毒死了,對(duì)吧？
所以對(duì)自然界控冰體系的、生物體系的研究，必然會(huì)為我們冷凍保存提供新的思路。
確實(shí)也有很多科學(xué)家研究為什么這些蟲子能在低溫下生存？他們發(fā)現(xiàn)蟲子體內(nèi)主要存在的兩類蛋白能控制冰晶的形成：一類叫抗凍蛋白，它能控制冰晶的生長(zhǎng)；另一類叫冰晶核蛋白，它能控制冰晶的成核。
我得說(shuō)一下冰晶的形成可以分成兩步：一步是成核，一步是生長(zhǎng)。
成核最初是一百多年前美國(guó)的科學(xué)家吉布斯提出來(lái)的。他通過簡(jiǎn)單的宏觀的能量分析，提出冰晶的形成必然會(huì)經(jīng)過一個(gè)形成臨界冰核的階段。如果臨界冰核沒有形成的話，冰晶不可能生成。
經(jīng)典成核理論提出已經(jīng)一百多年了,但提出的時(shí)候, 這么多年一直有爭(zhēng)議，有些人支持這個(gè)經(jīng)典成核理論，有些人則反對(duì)經(jīng)典成核理論。
關(guān)鍵就是目前實(shí)驗(yàn)上沒有探測(cè)到臨界冰核的存在。
有三個(gè)難點(diǎn)：一個(gè)就是臨界冰核尺寸小。尺寸小到什么地步呢？是納米級(jí)別,相當(dāng)于我們頭發(fā)絲的幾萬(wàn)分之一；另外一個(gè)臨界冰核存在的時(shí)間窗口很短，瞬間的，是納秒級(jí)別，非?？欤涣硗庖粋€(gè)它是隨機(jī)發(fā)生的，隨機(jī)意味著什么？它不可預(yù)測(cè)，沒有規(guī)律。
由于以上三個(gè)難點(diǎn)，世界上最先進(jìn)的儀器，沒法捕捉到臨界冰核，導(dǎo)致了經(jīng)典成核理論是否適用于冰晶的形成，一直存在著爭(zhēng)議。
我們根據(jù)自然界當(dāng)中存在著兩類蛋白，一類就是冰晶核蛋白，是目前世界上最好的冰晶成核劑；另一類是抗凍蛋白，它沒有明顯的促進(jìn)冰核形成的效果。更有意思的事情，這兩類蛋白唯一的區(qū)別就是尺寸不一樣?？箖龅鞍准{米級(jí)別，冰晶核蛋白是幾十納米，兩者差一個(gè)數(shù)量級(jí)。
為什么尺寸對(duì)冰核的形成如此重要？換句話說(shuō)，是不是可以制備一系列的不同尺寸的這類蛋白，讓它去探索這個(gè)臨界冰核，是不是可以把臨界冰核捕捉??？
事實(shí)上，我們通過生物工程的方法制備了一系列的蛋白，但是遺憾的是，這類蛋白大到十幾納米的時(shí)候，機(jī)械性能不好，它會(huì)產(chǎn)生彎曲，所以這種蛋白材料，不可能用來(lái)單變量的研究尺寸的影響，所以我們繼續(xù)找，找到另一種材料叫氧化石墨烯。
氧化石墨烯就是很薄的一層片層，并且它的機(jī)械性能非常好。我們可以制備一系列尺寸氧化石墨烯。這是氧化石墨烯的電子顯微鏡圖片，可以從3納米、8納米、11納米、21納米、50納米等等。我們就可以用這些納米顆粒去模擬蛋白，去研究尺寸對(duì)冰晶成核的影響。
確實(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯納米顆粒的尺寸，與冰晶成核過冷度的乘積是一個(gè)固定值，并且這個(gè)固定值具有普適性。它對(duì)氧化石墨烯的狀態(tài)，無(wú)論是分散在水里面的，還是固定在表面的不同顆粒都適用。
這么一個(gè)普適的物理現(xiàn)象，必然后面有一個(gè)理論機(jī)制。
當(dāng)然我們通過理論分析發(fā)現(xiàn)，其實(shí)氧化石墨烯上臨界冰核的形成過程，與我們往杯子里面倒水的這個(gè)過程相類似。當(dāng)我們往杯子里面倒水的時(shí)候，水平面與杯沿齊平的時(shí)候，水不會(huì)溢出來(lái)。我們繼續(xù)倒水，水會(huì)鼓出來(lái)，這時(shí)候表面張力會(huì)把水包住。繼續(xù)倒水，鼓到一定臨界程度的時(shí)候，水會(huì)忽然溢出來(lái)。
臨界冰核也是這種情況，它會(huì)在氧化石墨烯上形成，迅速漲到納米顆粒的邊緣。這時(shí)候由于在表面張力作用下，它不會(huì)形成冰晶，只有它繼續(xù)鼓，鼓到一定程度，它會(huì)忽然瞬間的形成冰晶。進(jìn)一步理論分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氧化石墨烯的顆粒，與臨界冰核的尺寸相當(dāng)?shù)臅r(shí)候，冰晶才有可能形成。
那就意味著，我們可以用納米顆粒，做一把尺子去量臨界冰核，從而我們就證實(shí)了一百多年前吉布斯等人預(yù)測(cè)的臨界冰核的存在。
接下來(lái)我們繼續(xù)講講這個(gè)能控制冰晶生長(zhǎng)的抗凍蛋白的控冰機(jī)制。
這是2013年我去新疆采集樣品的現(xiàn)場(chǎng)照片，可以看到蟲子就在雪和土壤之間。這個(gè)蟲子能在酷寒下生存的重要原因之一，就是體內(nèi)存在抗凍蛋白。
抗凍蛋白有兩個(gè)面,就像我們手機(jī)一樣，當(dāng)然尺寸是納米級(jí)別的。
最初是一個(gè)美國(guó)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了這種抗凍蛋白，所以很多科學(xué)家研究了抗凍蛋白的抗凍冰機(jī)制。但是五十多年來(lái)，關(guān)于抗凍蛋白它是喜歡冰或者不喜歡冰，一直存在爭(zhēng)議。
我是2010年開始做這個(gè)研究的。我發(fā)現(xiàn)所有這些研究，它沒有明確到底哪一個(gè)面喜歡冰，或者哪一個(gè)面不喜歡冰？我就想，我能不能把納米尺度的抗凍蛋白定向固定住，然后選擇性研究抗凍蛋白每一個(gè)面的親冰或者親水性能。
這個(gè)想法當(dāng)然算不錯(cuò)了，示意圖畫的很簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)操作上是非常困難的。
我的兩個(gè)博士生去做這個(gè)事情，最后有個(gè)叫劉凱的碩博生，克服了兩個(gè)困難，一個(gè)要把是納米級(jí)別的，用手機(jī)定向固定是非常難的；另外一個(gè)，我定向固定還不夠，還要維持蛋白的活性，花了可能六年的時(shí)間，他做到了。發(fā)現(xiàn)蛋白有兩個(gè)面，每個(gè)面的親冰、親水不一樣，一面親冰，一面親水。
為什么之前有這個(gè)爭(zhēng)議？相當(dāng)于我們有個(gè)“盲人摸象”的故事一樣。
我們通過定向固定，選擇性研究抗凍蛋白的性能，解決了這個(gè)爭(zhēng)議。
解決這個(gè)爭(zhēng)議以后，對(duì)我們理解抗凍蛋白的控冰機(jī)制有什么幫助呢？
大家看一下這個(gè)示意圖：蛋白它一面親冰，可以跟冰很好的結(jié)合；一面親水，可以跟水很好的結(jié)合。這樣就在冰水界面形成很薄的一層蛋白層面，或者分子層面的一堵墻，阻礙了水變成冰，這就是一個(gè)抗凍蛋白的控冰機(jī)制。
通過我們對(duì)自然界控冰體系的研究，我們可以看出，自然界它不是用簡(jiǎn)單地加大量的鹽去保護(hù)自己，而是通過控制冰的成核，控制冰的生長(zhǎng)。
我們算有所發(fā)現(xiàn)，在有所發(fā)現(xiàn)以后，我們也做到了有所創(chuàng)造，這是我們做材料的一個(gè)特色。
我們制備了一些能控制冰晶形成的冷凍保護(hù)材料。比如我們目前輔助生殖技術(shù)里面，要用大量的凍存液凍存生殖細(xì)胞，精子、卵子、還有受精卵等等。目前這些凍存液都來(lái)源于外國(guó)進(jìn)口，更嚴(yán)重的是，這些凍存液用的是傳統(tǒng)的方法，含有一些二甲基亞砜，剛才我說(shuō)了它有毒的。用我們的這個(gè)分子凍存卵母細(xì)胞以后，它復(fù)蘇率優(yōu)于目前市場(chǎng)上二甲基亞砜含量15%的，細(xì)胞的復(fù)蘇率遠(yuǎn)優(yōu)于進(jìn)口的二甲基亞砜含量為零的復(fù)蘇率。
目前我們?cè)跂|莞松山湖材料實(shí)驗(yàn)室的支持下，嚴(yán)格按照國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，正在生產(chǎn)這些凍存試劑。當(dāng)然我們也研制了一系列能用于干細(xì)胞凍存的凍存液。
比如我們用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞凍存的材料。用我們這個(gè)材料凍存干細(xì)胞以后，它的復(fù)蘇率達(dá)到了92%，優(yōu)于或者遠(yuǎn)優(yōu)于市場(chǎng)上有毒的二甲基亞砜含量為10%的凍存液。
目前我們與北醫(yī)三院的眼科合作，我們希望通過我們創(chuàng)制的一些新的控冰材料，通過從凍存簡(jiǎn)單的組織器官入手，比如說(shuō)眼角膜的凍存。
希望通過我們材料的創(chuàng)新，使凍存技術(shù)得到進(jìn)步，當(dāng)然是突破性的進(jìn)步，讓許多醫(yī)療技術(shù)能充分發(fā)揮它們挽救生命的能力。
這是我的一個(gè)德國(guó)合作者，他2018年去南極捕魚，提取魚內(nèi)的抗凍蛋白。
大家知道前段時(shí)間有報(bào)道，我們一般的老百姓可以到空間站去待幾天，當(dāng)然這是距離比較短的。
我們知道宇宙很廣袤，如果想要旅行的話，可能會(huì)花幾十年算少的。我們從地球到那個(gè)地方，如果沒有采取措施的話，可能生命已經(jīng)結(jié)束了。
我們希望與世界上不同領(lǐng)域的科學(xué)家合作，使冷凍保存助力我們以后的星際旅行。
