微條形碼技術(shù)是一種通用技術(shù)，可為生物、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域的微米和納米級(jí)應(yīng)用程序提供多重和高通量信息存儲(chǔ)。但是，當(dāng)前的熒光條形碼技術(shù)主要使用光譜多路復(fù)用和熒光強(qiáng)度（FI）編碼，它們通常容易受到編碼元素的光譜重疊的影響。此外，由于樣品濃度和外部微環(huán)境的可變性，很難獲得定量的讀數(shù)。利用熒光壽命（fluorescence lifetime），在微條形碼區(qū)域能提供可重現(xiàn)輸出。借助最新的顯微成像技術(shù)，熒光壽命可以用作一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，最大程度地降低傳統(tǒng)熒光條形碼的局限性，隨著時(shí)間的推移提供可重復(fù)且定量的讀數(shù)。但是，尋找能夠靈活調(diào)節(jié)熒光壽命的響應(yīng)材料仍然是一項(xiàng)持續(xù)的挑戰(zhàn)。
研究成果
基于以上問題，來自英國(guó)伯明翰大學(xué)化學(xué)學(xué)院的Rachel K. O’Reilly教授課題組設(shè)計(jì)了一種由兩種成分組成的光可切換（photo-switchable）納米凝膠，該凝膠在通過光輻照引起的光致異構(gòu)化誘導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移過程中表現(xiàn)出可變的熒光壽命。可以使用熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）直觀地繪制這種遠(yuǎn)程操縱的熒光壽命特性，從而可以在微尺度上選擇性地存儲(chǔ)和顯示信息。并且，在細(xì)胞器成像中，可將活細(xì)胞和亞細(xì)胞細(xì)胞器的熒光壽命成像中的背景影響降至最低。相關(guān)成果以“Manipulating the fluorescence lifetime at the sub-cellular scale via photo-switchable barcoding”為題，發(fā)表在《Nature communciation》上。
圖文解析
1. 光開關(guān)納米凝膠的設(shè)計(jì)與制備
作為一種非破壞性性刺激，光是用于無需外部接觸即可進(jìn)行外部操縱的重要工具之一，因此非常適合信息標(biāo)記、實(shí)時(shí)標(biāo)記和選擇性跟蹤。在這項(xiàng)研究中，研究者設(shè)計(jì)了一種基于光的可切換壽命條形碼系統(tǒng)，該系統(tǒng)基于包含取代的馬來酰亞胺（DTM）和螺吡喃（SP）開關(guān)的兩組分納米凝膠。通過誘導(dǎo)可逆的光異構(gòu)化過程，可以通過DTM熒光基團(tuán)與SP光致變色劑的開環(huán)形式之間的F?rster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)現(xiàn)具有相似結(jié)構(gòu)但具有多重壽命的納米凝膠，從而實(shí)現(xiàn)了可控的、非可控的動(dòng)態(tài)熒光壽命編碼。
2. 評(píng)估光異構(gòu)化過程中的能量轉(zhuǎn)移和光物理行為
DTM在交聯(lián)的聚合物環(huán)境中受到保護(hù)，在450-600 nm范圍內(nèi)發(fā)出綠色光，并具有高的熒光量子產(chǎn)率。相比之下，在500和600 nm之間，SP的閉環(huán)形式的吸收可忽略不計(jì)，而光致變色染料的開環(huán)形式在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收，為高效FRET提供了理想方案（圖2a）。時(shí)變密度泛函理論（TD-DFT）計(jì)算表明，僅當(dāng)SP作為開環(huán)異構(gòu)體存在時(shí)才發(fā)生FRET（圖2b）。
當(dāng)在大約25nm激發(fā)時(shí)，DTM的熒光發(fā)射在納米凝膠環(huán)境中保持綠色發(fā)射（450-600 nm）。相反，在輻照同時(shí)包含DTM和SP的納米凝膠（N2-4）時(shí)，DTM通道中的綠色發(fā)射逐漸減少，并在610 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)新峰，表明FRET供體/DTM和開環(huán)的SP之間形成了一對(duì)受體（圖2c）。如預(yù)期的那樣，可以通過用可見光照射完全恢復(fù)DTM發(fā)射，在此期間，通過將SP切換回閉環(huán)形式來阻止FRET過程。
3. 光刺激的可逆熒光壽命
時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC）的熒光壽命成像顯微鏡被用作解碼技術(shù)，用于可視化局部熒光壽命。首先通過監(jiān)測(cè)不同發(fā)射波長(zhǎng)下的壽命衰減來比較二維時(shí)間分辨的熒光衰減光譜。可以觀察到了DTM通道中N4溶液的熒光壽命降低，由于受光刺激的FRET，開環(huán)SP的新的熒光衰減出現(xiàn)在600至650 nm之間。如圖3a，b所示，UV照射后，N1-4中的平均壽命可以從15 ns調(diào)整到28 ns，而且與兩種單體的比例線性相關(guān)。此外，通過調(diào)整到達(dá)穩(wěn)定階段之前的紫外線照射時(shí)間，可以在同一納米凝膠中獲得多個(gè)壽命（圖3c，）。N4的整個(gè)壽命衰減在UV和可見光的4個(gè)循環(huán)中是完全可逆的，沒有任何可測(cè)量的變化（圖3d）。通過熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）進(jìn)一步可視化了這種可逆行為，其中可以觀察到不同的壽命。
4. 活細(xì)胞中可逆的熒光壽命條形碼
最后，研究者試圖研究在細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞內(nèi)編碼和解碼過程。為了靶向線粒體，在通過疊氮化物反應(yīng)基團(tuán)官能化納米凝膠后，通過疊氮炔環(huán)加成將TPP與納米凝膠偶聯(lián)（圖4a）。通過共聚焦熒光分析，在TPP-N6的DTM通道和商用Mito Tracker的紅色通道之間觀察到共定位，TPP-N6的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（PCC）為0.85，而沒有TPP修飾（0.57）的納米凝膠，表明這些材料在線粒體內(nèi)的成功定位（圖4b）。而且，跟蹤劑基團(tuán)的并入不會(huì)影響納米凝膠系統(tǒng)的可逆性。與具有自發(fā)熒光效應(yīng)的傳統(tǒng)壽命條形碼材料相比，這種納米凝膠系統(tǒng)中熒光壽命的可逆性提供了一種策略，可通過減少信號(hào)強(qiáng)度來放大信噪比。
總結(jié)
在本文中，研究者開發(fā)了一種通過光致異構(gòu)化誘導(dǎo)的FRET過程來遠(yuǎn)程控制聚合物納米凝膠中熒光壽命。這些納米凝膠系統(tǒng)進(jìn)一步用于使用FLIM進(jìn)行熒光壽命條形碼掃描，從而達(dá)到可控、可逆和非侵入性方法跟蹤并選擇性地可視化熒光多態(tài)的目的。通過同時(shí)提取壽命作為讀數(shù)，納米凝膠系統(tǒng)能夠選擇性地以定量結(jié)果進(jìn)行解碼，從而允許以微尺度存儲(chǔ)信息。作為概念驗(yàn)證，通過點(diǎn)擊反應(yīng)將線粒體追蹤劑引入納米凝膠，從而獲得亞細(xì)胞規(guī)模的活細(xì)胞壽命條形碼，提高了成像的靈敏度。
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