通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化氫（H2O2）是癌細(xì)胞中可自由擴(kuò)散的分子之一，被認(rèn)為是了解細(xì)胞生理和病理的重要細(xì)胞信號(hào)分子。其中，正常的生理的H2O2水平在產(chǎn)生和分解代謝之間保持平衡。然而，在癌細(xì)胞中的H2O2水平會(huì)顯著增高，H2O2會(huì)從活細(xì)胞擴(kuò)散到細(xì)胞膜上。因此，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞釋放H2O2對(duì)了解腫瘤細(xì)胞間的行為和異質(zhì)性具有重要意義。但是，目前定量和區(qū)分從活細(xì)胞中釋放的H2O2還具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗诩?xì)胞外微環(huán)境中具有快速擴(kuò)散、自然分解和稀釋至超低濃度的特性。雖然利用電化學(xué)、比色法和化學(xué)發(fā)光法等分析技術(shù)可以檢測(cè)H2O2，但是對(duì)于生物相容性更好、制備更簡(jiǎn)單的信號(hào)探針、擴(kuò)散距離更短和背景干擾更低的檢測(cè)技術(shù)還需要進(jìn)一步的研究。
基于此，清華大學(xué)的林金明教授和國(guó)家納米科學(xué)中心的Lin?Ling（共同通訊作者）聯(lián)合報(bào)道了一種利用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）進(jìn)行功能化的液晶彈性體微球（LCEM-HRP），可以將其直接固定在細(xì)胞膜上，進(jìn)而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞水平上H2O2的釋放。LCEM-HRP可以通過(guò)同中心向徑向（C-R）變形來(lái)報(bào)告H2O2，這是由于LCEM-HRP中的H2O2被HRP催化還原而引起的去質(zhì)子化和LCEM-HRP中鏈間或鏈內(nèi)氫鍵的斷裂所致。其中，LCEM-HRP的變形水平顯示了從細(xì)胞釋放H2O2的不同量。在檢測(cè)時(shí)間為10 min內(nèi)，固定在細(xì)胞上的LCEM-HRP的估計(jì)檢測(cè)靈敏度為?2.2×10-7?μM。此外，研究人員還從不同構(gòu)型的LCEM-HRP中探索了細(xì)胞系和細(xì)胞的異質(zhì)性?？傊琇CEM-HRP通過(guò)原位實(shí)時(shí)成像監(jiān)測(cè)從活細(xì)胞中釋放的H2O2提供了一種新方法，并且可以作為尋找用于細(xì)胞微環(huán)境中各種信號(hào)分子成像的更高級(jí)化學(xué)探針的基礎(chǔ)。該研究成果以題為“Monitoring H2O2?on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal?Elastomer Microspheres”發(fā)布在國(guó)際著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.上。
【圖文解讀】
首先，研究人員通過(guò)溶解二丙烯酸酯液晶（2-甲基-1,4-亞苯基雙（4-（（（丙烯酰氧基）己基）氧基）苯甲酸酯）（RM82）、E7（LC）中的7-辛烯酸（7OAc）單體和偶氮二異丁腈（AIBN）合成了直徑約2 μm和天然徑向構(gòu)型的LCEM。接著，利用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）對(duì)液晶彈性體微球（LCEM）進(jìn)行化學(xué)修飾形成LCEM-HRP，并將其直接固定在細(xì)胞膜上，以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從單活細(xì)胞中釋放的H2O2。與LCEM相似，LCEM-HRP在pH=7.4的水溶液（去離子水，DIW）和細(xì)胞培養(yǎng)基（MEM）中表現(xiàn)出徑向構(gòu)型。通過(guò)將熒光染料若丹明標(biāo)記的HRP（HRPrhd）結(jié)合到LCEM（LCEM-HRPrhd）上，可以確定將HRP固定在LCEM上。
接著，研究人員研究了在pH=6.7下、不同H2O2濃度（0.5-5 M）的溶液，發(fā)現(xiàn)LCEM和LCEM-HRP都具有響應(yīng)性。在此pH下，LCEM和LCEM-HRP均表現(xiàn)出同心構(gòu)型。但是，在0.5 M的CH2O2處觀察到LCEM-HRP有輕微同心向徑向變形，在CH2O2>0.5 M時(shí)徑向構(gòu)型更加明顯。在CH2O2=1.2 M處，LCEM的同心構(gòu)型得以保留，而LCEM-HRP顯示C-R變形。利用電子自旋共振（ESR）光譜檢測(cè)了在H2O2存在下LCEM-HRP產(chǎn)生自由基氧物質(zhì)（ROS）的情況。從H2O2+HRP和H2O2+LCEM+HRP中觀察到DMPO-OH和DMPO-OOH的ESR信號(hào)，而在LCEM-HRP和H2O2的存在下，?OH信號(hào)顯著淬滅。將LCEM-HRP置于pH=6.7的H2O2（1.2 M）溶液中，以評(píng)估其可逆變形。添加H2O2后，LCEM-HRP的初始同心構(gòu)型變?yōu)閺较驑?gòu)型。
然后，研究人員將LCEM或LCEM-HRP分散在細(xì)胞培養(yǎng)基（MEM）中，并使其固定在微通道中的細(xì)胞上。最初，LCEM-HRP在HUVEC細(xì)胞上還表現(xiàn)出徑向構(gòu)型，在A549、U87和HepG-2細(xì)胞上表現(xiàn)出同心構(gòu)型。但是，LCEM-HRP并未保持其同心構(gòu)型，在分析時(shí)間為10 min下，在A549、U87和HepG-2細(xì)胞上觀察到了C-R變形。LCEM和LCEM-HRP都在HUVEC細(xì)胞上保留了其徑向構(gòu)型，而在初始時(shí)就在U87、A549和HepG-2細(xì)胞中觀察到了快速的R-C變形。所以這種R-C變形是由于腫瘤細(xì)胞的酸性環(huán)境所導(dǎo)致。LCEM在腫瘤細(xì)胞上保持其同心構(gòu)型，而LCEM-HRP隨著時(shí)間的推移顯示出反向的C-R變形。這種C-R變形是由于HRP催化從細(xì)胞釋放的H2O2減少所導(dǎo)致。此外，由于合成代謝的改變，其他信號(hào)分子也從腫瘤細(xì)胞中釋放出來(lái)，以滿足細(xì)胞增殖的高生物合成需求。
研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)從活細(xì)胞釋放的信號(hào)分子可以提高對(duì)靶向疾病以及新治療和診斷方法的了解。因此，研究人員通過(guò)在10 min內(nèi)達(dá)到100個(gè)單細(xì)胞上的LCEM-HRP構(gòu)型分析了不同細(xì)胞系之間的差異性。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同的細(xì)胞系釋放的H2O2具有顯著的差異。LCEM-HRP的形狀分為從初始同心到預(yù)同心、預(yù)徑向和徑向四個(gè)階段。72％的A549、14％的U87和僅2％的HepG-2細(xì)胞釋放的H2O2足以帶來(lái)完整的C-R變形。這些結(jié)果表明，LCEM-HRP提供了一種可靠的方法來(lái)分析從活細(xì)胞釋放的H2O2，并繪制了細(xì)胞系和細(xì)胞-細(xì)胞異質(zhì)性圖。
【小結(jié)】
綜上所述，LCEM-HRP提供了一種以單細(xì)胞分辨率下原位實(shí)時(shí)成像檢測(cè)從活細(xì)胞中釋放的H2O2的可靠方法。LCEM-HRP探索了不同腫瘤細(xì)胞系表面相同的細(xì)胞間的異質(zhì)性。LCEM-HRP不會(huì)發(fā)生內(nèi)吞作用，因此可以簡(jiǎn)單地固定在細(xì)胞膜上，具有較高的細(xì)胞相容性、較低的運(yùn)行成本、超高的靈敏度以及短的分析時(shí)間（10 min）。此外，LCEM-HRP可以成為追求更先進(jìn)的化學(xué)探針以監(jiān)測(cè)來(lái)自活細(xì)胞的各種信號(hào)分子成像的基礎(chǔ)。
文獻(xiàn)鏈接：
Monitoring H?2?O?2?on the Surface of Single Cells with Liquid Crystal?Elastomer Microspheres?（Angew. Chem. Int. Ed.,?2020,?DOI:?10.1002/anie.202004326）
