關節(jié)軟骨是關節(jié)中的彈性結締組織。軟骨損傷是非常普遍的，但是由于其低細胞性和無血管性質，軟骨具有有限的自我修復能力。由于軟骨的損傷導致膝關節(jié)功能障礙，導致關節(jié)炎的關節(jié)嚴重疼痛和殘疾，因此軟骨或關節(jié)重建仍然是相當大的挑戰(zhàn)。在臨床實踐中關節(jié)炎關節(jié)由全關節(jié)成形術使用金屬和合成的假體?，F有的關節(jié)假體不會與宿主關節(jié)組織重塑，并且可能因無菌性松動或感染而導致長期衰竭，只能通過關節(jié)的生物再生來解決。
使用間充質干細胞（MSC）移植，然后刺激定向分化為軟骨細胞正在成為軟骨修復的首選。近日，南京醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院和上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院研究人員在《Science Advances》上發(fā)表了題為“3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration”的研究論文，描述了三維（3D）生物打印雙因子釋放和梯度結構構造的各向異性軟骨再生。
載有雙因子的間充質干細胞（MSC）負載的水凝膠用于各向異性軟骨形成的分化。3D生物打印各向異性軟骨構造與賦予機械強度的物理梯度合成生物可降解聚合物一起，證明了整個層的完整性，表層的潤滑以及深層的營養(yǎng)供應。在體外和體內對軟骨組織的評估表明，組織的成熟和組織具有轉化前景。
3D生物打印以制造雙因子釋放和梯度結構的軟骨構建體
為了更好地模擬天然軟骨，研究人員結合了具有不同生長因子釋放的生化刺激（BCS）和具有較小孔徑的生物力學刺激（BMS），以誘導更好的軟骨形成，從而在創(chuàng)建了雙因子釋放和梯度結構的軟骨構造刺激（DS）組。在軟骨構造中，通過聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）（50:50 PLA / PGA）微球用于在水凝膠中遞送TGFβ3和BMP4引入骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）和轉化生長因子β3（TGFβ3）的組合。
用于植入的3D生物打印梯度軟骨支架
對于兔軟骨構建體，支架為4×4×4 mm；對于人軟骨構建體，則為14×14×14 mm。將TGFβ3和BMP4微球分別混合在充滿細胞的水凝膠中，并使用不同的注射器將其印刷到PCL纖維之間的微通道中。為了化學模擬天然軟骨中的肥大層，研究人員在最深的層中使用了PLGA BMP4包裹的MSC負載水凝膠，其PCL纖維間距為750μm，而PLGA-TGFβ3用于軟骨構造的其他三層。
雙重釋放因子納米顆粒對BMSCs體外存活和增殖的影響
在支架中檢查了細胞活力和增殖。印刷的載有細胞的水凝膠使細胞沿印刷路徑的縱向排列，形成具有細胞相互作用的網狀網絡。最終構建物中的PCL支柱結構進一步穩(wěn)定了3D打印的BMSC組織，從而在充滿細胞的水凝膠中誘導了細胞排列模式的壓實現象?；?死細胞分析顯示，第0天的細胞活力≥95％，在第3天到第21天保持超過75％的活力。表明一步法3D生物打印的雙因子釋放和梯度結構優(yōu)化的軟骨支架在打印過程中保留了細胞活力，并為BMSC的增殖，擴散和濃縮提供了有利的微環(huán)境，以在體外分化為軟骨細胞。
時空釋放的rhTGFβ3和rhBMP4在3D生物打印的梯度結構支架中體外誘導軟骨基質形成
在支架的體內應用之前，研究人員確定了rhTGFβ3和rhBMP4的時空傳遞是否誘導層特異性BMSC分化成軟骨細胞并呈現出透明的關節(jié)和肥大的表型。
具有透明質和肥大表型的關節(jié)軟骨細胞首先是從兔骨髓間充質干細胞體外獲得的。透明質軟骨細胞同時產生聚集蛋白聚糖和II型膠原，而肥大軟骨細胞同時產生I型膠原和X型膠原。
在培養(yǎng)物中連續(xù)施用rhTGFβ3 2周，然后再進行rhTGFβ3 4周，誘導BMSCs分化為軟骨細胞，該軟骨細胞合成了聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白，表明是透明的關節(jié)軟骨樣細胞。。
此外，TGFβ3誘導的組織中的細胞是成纖維細胞，而BMP4誘導的細胞則更大，類似于先前在培養(yǎng)物中產生的肥大軟骨細胞。兩種處理均誘導BMSC分化并產生軟骨基質，該基質在濃縮的BMSC中對甲苯胺藍和阿爾辛藍染色呈陽性，表明富含蛋白聚糖，軟骨樣ECM。
雙因子釋放和梯度結構支架在兔膝關節(jié)軟骨缺損模型體內顯示出更好的軟骨修復效果
將兔用作動物模型以評估軟骨支架的膝蓋修復能力。與BCS和BMS支架相比，DS支架在第8、12和24周的軟骨修復表現出更好的總體外觀。在移植后的24周期間，對膝關節(jié)手術進行了磁共振成像，這表明DS組在24周后軟骨下水腫的分辨率和關節(jié)表面的愈合明顯更好。
此外，與NG組相比，梯度支架組在體內24周內顯示出更好的軟骨保護作用，組織學評分明顯更高，在24周內具有更好的修復效果。DS各向異性支架比BCS或BMS組具有更好的軟骨修復效果，并且移植后保持較好的關節(jié)功能。
雙因子釋放和梯度結構支架恢復了天然軟骨的各向異性和更好的微血管向內生長
隨著天然關節(jié)軟骨從淺表層區(qū)域向深層區(qū)域的轉變，不同表型的軟骨細胞呈現出較高的潤滑性和淺表層的GAG（PRG4，ACAN表達）以及深層的骨化（RUNX2，COL10A1表達）。
在本研究中，我們進一步測試了所生成軟骨的各向異性，并將其與天然軟骨進行了比較。在表層，免疫染色顯示與其他兩組相比，DS組和天然軟骨中PRG4和ACAN的表達更高（圖6，A至C）。
同時，植入雙因子釋放和梯度結構支架的組也觀察到了骨化標記物（RUNX2和COL10A1）的較高表達（圖6，D至F）。這些結果表明，雙因子釋放和梯度結構支架可以更好地恢復天然軟骨在特定層中具有不同的成軟骨和骨化標記物的各向異性。
此外，DS支架類似于天然軟骨深層的向內生長的微血管，與孔徑較小的組相比，DS支架可以更好地促進微血管向內生長，這表明在深部區(qū)域，孔徑較大的組織具有更好的營養(yǎng)供應和組織整合。
展望
總之，研究人員設計了具有結構完整性的3D生物打印各向異性構造，用于關節(jié)重建和關節(jié)軟骨再生，并進一步在兔軟骨缺損模型中測試了功能性膝關節(jié)軟骨構造。
通過順序印刷帶有梯度結構的合成PCL聚合物的蛋白釋放蛋白和MSC載水凝膠，可以創(chuàng)建具有所需結構完整性并準備用于外科手術植入的人規(guī)模軟骨構建體，該技術也可以用于再生軟骨整個關節(jié)。與PCL支架相結合的打印為水凝膠提供了均勻性，并為體內研究提供了所需的機械性能。在本研究中，充滿細胞的水凝膠可以使MSC和蛋白質包裹的微球分布均勻，從而保護細胞活力并促進其在支架中的分化和擴增。
同時，相鄰的PCL腳手架提供了足夠的機械支撐和結構完整性，為水凝膠中的3D錨定MSC細胞提供了穩(wěn)定的微環(huán)境，以分化并形成組織，其分泌的軟骨基質隨著水凝膠的緩慢降解而替代了水凝膠。
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